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本产品包含Pfu DNA Polymerase、dNTP以及优化的缓冲体系，只需加入引物和模板即可进行扩增，减少了移液操作，提高了检测通量和结果的重现性。扩增体系中加入的保护剂使得2×Pfu Master Mix (Dye Plus)反复冻融后仍可保持稳定活性。本品含有电泳缓冲液和染料，可在反应结束后直接进行电泳，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可大限度的减少人为误差。Pfu DNA polymerase可以扩增较长的DNA片段，但大多数时候比较适合扩增5kb以下的片段，更长片段的扩增推荐使用其它更适合长片段扩增的DNA聚合酶。Pfu DNA Polymerase的PCR产物为平末端，可加A处理再与T-载体连接或使用平末端克隆载体。

• 操作注意事项
  
  • 由于Pfu DNA Polymerase在室温下也有一定的反应活性，PCR反应体系请在冰上进行配制，之后再置于PCR仪上进行反应。这样可以减少在反应准备阶段发生的非特异扩增，有助于得到高特异性的扩增结果。
    
  • 电泳时色素Marker位置：反应液5μL，1%Agarose电泳时，蓝色色素在3～5kb附近，黄色色素在50bp以下位置。
• 引物设计要点
  
  • 引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；
    
  • 引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配；
    
  • 引物3’端应避免出现发夹结构；
    
  • 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳，Tm值调整至55～65℃为佳(引物Tm值推荐使用Primer Premier 5进行计算)；
    
  • 引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；
    
  • 引物的GC含量控制在40～60%之间；
    
  • 引物A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域；
    
  • 避开引物内部或者两条引物之间有5个碱基以上的互补序列，两条引物的3’端避免3个碱基以上的互补序列；
    
  • 引物设计完毕请使用NCBI BLAST功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。

• PCR反应体系
  

  成分	用量
  ddH2O	至50μL
  2×Pfu Master Mix (Dye Plus)	25μL
  模板DNA	optional
  引物1(10μM)	2μL
  引物2(10μM)	2μL

  
  注：50μL反应体系不同模板的推荐使用量如下表。
  

  模板种类	扩增片段
  基因组DNA	100ng～1μg
  质粒DNA	10pg～20ng
  cDNA	1～5μL(不超过反应体系的1/10)

  
  
• PCR扩增程序
  

  循环步骤	温度	时间	循环数
  预变性	94℃	30sec～3min	1
  变性	94℃	20～30sec	30-35
  退火	55℃	30sec
  延伸	72℃	0.5kb/min
  终延伸	72℃	5～10min	1

  
  注：
  
  • 预变性温度和时间：推荐使用94℃；对于高GC模板，推荐变性温度为98℃。预变性推荐时间：质粒DNA等简单模板为30sec；cDNA、基因组DNA等复杂模板为3min。
    
  • 退火温度和时间：可根据需要，设立温度梯度去摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间设置为20sec，可以在10～30sec内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。
    
  • 扩增产物：请将PCR扩增产物放置于-20℃保存，防止DNA发生降解。